2010年12月9日，我所王曉晨實驗室在PLoS Genetics雜誌在線發表題為「Endocytic Sorting and Recycling Require Membrane Phosphatidylserine Asymmetry Maintained by TAT-1/CHAT-1」的文章。該文章首次報導了秀麗線蟲磷脂醯絲氨酸轉運蛋白TAT-1及其分子伴侶CHAT-1通過維持磷脂醯絲氨酸在內涵體膜上的不對稱性分布從而調控細胞內有效的內吞分選(endocytic sorting)及循環(recycling)過程。
早期內涵體(early endosome)是細胞內的「貨物分選站」。內吞分選是早期內涵體(early endosome)通過形成若干形態與功能各異的亞結構而實現的。已知需要被循環利用的蛋白如某些受體等在早期內涵體將被分選而轉運到新形成的管狀膜泡上，從而回到細胞膜上繼續行使其功能，而這種內吞循環過程中的管狀膜泡的形成是如何被調控的還知之甚少。我們的工作表明，秀麗線蟲磷脂醯絲氨酸轉運蛋白TAT-1及其分子伴侶CHAT-1對於這種管狀膜泡的形成至關重要，而該功能很有可能是通過維持早期內涵體膜上磷脂醯絲氨酸的不對稱性分布而實現的。
我們從一個調控凋亡信號磷脂醯絲氨酸外翻缺陷的遺傳篩選中得到了編碼磷脂醯絲氨酸轉運蛋白TAT-1及其分子伴侶CHAT-1的功能失活突變體。TAT-1屬於P類ATP水解酶家族，這類蛋白與生物膜上磷脂醯脂類的分布調控相關。在野生型的凋亡細胞表面可以檢測到磷脂醯絲氨酸的暴露，這是凋亡細胞早期最顯著的凋亡信號，而在活細胞表面磷脂醯絲氨酸都被限制在細胞膜內側。在tat-1和chat-1突變體中，在凋亡細胞和活細胞表面我們都可以檢測到磷脂醯絲氨酸，這與之前薛定實驗室關於TAT-1的研究結果是一致的。我們發現TAT-1與CHAT-1在多種細胞類型中共定位，在亞細胞水平上，它們在細胞膜和細胞器膜上也共定位。進一步研究表明，它們需要彼此才能從內質網被運輸到細胞器膜和細胞膜上執行功能。這是首次對秀麗線蟲中TAT-1分子伴侶CHAT-1的研究報導。
這兩個突變體除了具有磷脂醯絲氨酸在活細胞表面暴露的表型之外，研究發現在幼齡四期線蟲及成蟲的腸系細胞中累積了很多異常變大的膜泡。通過一系列內吞系統的分子標記分析表明這些膜泡上具有早期內涵體蛋白RAB-5，晚期內涵體與早期溶酶體蛋白RAB-7，以及循環內涵體蛋白RAB-10和RAB-11。hTfR、hTAC和GLUT1(線蟲葡萄糖轉運受體)是細胞膜表面受體，在野生型中這些蛋白在內吞發生後會較快地被轉運回到細胞膜上，因此它們主要定位在細胞膜上，而在突變體中這些蛋白很大比例滯留在細胞中，細胞膜上的定位大大減少。線蟲通過降解卵黃蛋白為發育提供營養，突變體的胚胎和成蟲與同時期野生型相比，有明顯的卵黃蛋白降解缺陷。此外，在腸系細胞中有較多的細胞自噬(autophagy)蛋白LGG-1聚積，表明細胞自噬的降解可能也有缺陷。
為了深入研究為何突變體中存在內吞循環缺陷和降解缺陷，我們檢測了TAT-1和CHAT-1在腸系細胞中的亞細胞水平定位。TAT-1和CHAT-1主要定位在細胞膜，早期內涵體及管狀膜泡的細胞器膜上。與RAB-5、RAB-10和RAB-11的共定位研究表明這些管狀膜泡是從早期內涵體發出的循環內涵體。已知RAB-10促進循環內涵體的生成，RME-1促進循環內涵體頂端形成球狀膜泡並脫離管狀膜泡。在rab-10突變體中，觀察不到CHAT-1標記的管狀膜泡；而在rme-1突變體中，管狀膜泡比野生型中更加明顯。這些結果進一步證實TAT-1和CHAT-1標記的管狀膜泡是循環內涵體。檢測CHAT-1和GLUT1的共定位發現，二者在管狀結構上很好的共定位，表明CHAT-1所標記的循環內涵體上具有循環轉運GLUT1的功能。在tat-1和chat-1突變體中，觀察不到這種GLUT1標記的管狀膜泡，與此同時GLUT1很大比例無法被循環運送到細胞膜上。
已有研究表明，TAT-1負責調控細胞膜上磷脂醯絲氨酸不對稱性分布。而細胞器膜上磷脂醯絲氨酸是否不對稱性分布，如果不對稱性分布，那麼是否由TAT-1調控均無研究報導。通過特異結合磷脂醯絲氨酸的LACT-C2分子標記，我們發現在腸系細胞包括早期內涵體、循環內涵體在內的多種細胞器膜外表面有磷脂醯絲氨酸分布。線蟲六個假體腔細胞有較大的內涵體和溶酶體，我們通過分泌的LACT-C2發現野生型內涵體膜內側無磷脂醯絲氨酸分布，而tat-1和chat-1突變體中能檢測到！以上結果表明，磷脂醯絲氨酸在內涵體膜上是不對稱性分布的，而這種不對稱性分布是由TAT-1和CHAT-1參與調控的。這是關於內涵體膜磷脂醯絲氨酸不對稱性分布及其調控的首次研究報導。我們認為，TAT-1和CHAT-1維持了內涵體上磷脂醯絲氨酸的不對稱性分布，而這種不對稱性分布對於細胞內有效的內吞分選和循環是至關重要的。
我所與北京協和醫學院聯合培養的博士生陳寶惠為本文的第一作者，其它作者還有姜嶽、曾勝、晏家驄、李欣、張燕和鄒煒。王曉晨博士為本文通訊作者。此項研究由科技部863計劃和北京市科委資助，在北京生命科學研究所完成。（生物谷Bioon.com）
生物谷推薦原文出處：
PLoS Genetics doi:10.1371/journal.pgen.1001235
Endocytic Sorting and Recycling Require Membrane Phosphatidylserine Asymmetry Maintained by TAT-1/CHAT-1
Baohui Chen1,2, Yue Jiang2, Sheng Zeng2, Jiacong Yan2, Xin Li2, Yan Zhang2, Wei Zou2, Xiaochen Wang2*
1 Graduate Program in Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing, China, 2 National Institute of Biological Sciences, Beijing, China
Abstract
Endocytic sorting is achieved through the formation of morphologically and functionally distinct sub-domains within early endosomes. Cargoes destined for recycling are sorted to and transported through newly-formed tubular membranes, but the processes that regulate membrane tubulation are poorly understood. Here, we identified a novel Caenorhabditis elegans Cdc50 family protein, CHAT-1, which acts as the chaperone of the TAT-1 P4-ATPase to regulate membrane phosphatidylserine (PS) asymmetry and endocytic transport. In chat-1 and tat-1 mutants, the endocytic sorting process is disrupted, leading to defects in both cargo recycling and degradation. TAT-1 and CHAT-1 colocalize to the tubular domain of the early endosome, the tubular endocytic recycling compartment (ERC), and the recycling endosome where PS is enriched on the cytosolic surface. Loss of tat-1 and chat-1 function disrupts membrane PS asymmetry and abrogates the tubular membrane structure. Our data suggest that CHAT-1 and TAT-1 maintain membrane phosphatidylserine asymmetry, thus promoting membrane tubulation and regulating endocytic sorting and recycling.