X射線晶體衍射、核磁共振和冷凍電鏡

結構生物學是現代生命科學研究的前沿主流學科之一，對生物大分子結構與功能的深入研究不僅可以解決一系列重大的基礎科學問題，幫助人們更好地理解生命現象本質，而且與人類健康息息相關，將極大地促進基於生物大分子結構的新藥研究及開發。——施一公

目前常用的解析蛋白質結構的方法主要有X射線晶體衍射技術、核磁共振技術和冷凍電鏡技術。

X射線晶體衍射技術

晶體向來以其規律性和對稱性而備受推崇，直到17世紀才漸漸被科學地研究。1611年，約翰內斯·克卜勒（Johannes Kepler）發現了雪花的對稱六角結構。從1895年威廉·倫琴（Wilhelm Rntgen）發現X射線，到1912年單晶X射線衍射技術提出並開發，再到1958年肌紅蛋白作為首個運用X射線晶體衍射技術解析出來的蛋白質結構，該技術已經成為解析蛋白質結構中最重要、最有力的工具。

圖源: 阿里雲

截止今天，PDB資料庫中已錄入的生物大分子結構將近17萬個，其中近90%的結構都來自於X射線晶體衍射技術，可見其功能的強大。晶體衍射技術可以解析出原子解析度的結構，但是該方法的局限之處在於，樣品必須是可結晶的。針對生物大分子，特別是膜蛋白和澱粉樣蛋白質，溶解度低，難以結晶或者不可結晶，則需要考慮使用其他的技術進行結構解析。

核磁共振技術

自1946年首次觀測到凝聚態核磁信號以來，NMR技術經歷了70多年的飛速發展，其應用也逐漸擴展到化學、醫學、材料科學和生命科學等領域。20世紀80年代，該技術開始應用於蛋白質結構解析，進一步促進了NMR技術在生命科學領域的應用。

核磁共振實驗室。圖源: 維基百科

目前，用於解析蛋白質結構的核磁共振技術主要分為液體核磁共振技術和固體核磁共振技術。兩者研究的對象不同，簡單來說，前者是以液體樣品為研究對象，後者則是以固態樣品為研究對象。

液體核磁共振解析生物大分子的結構時受限於其分子量，一般情況下常用來分析50 kDa以下的蛋白質。在一些特殊情況下，也可以用來解析100 kDa以上的膜蛋白。固體核磁共振技術，則不受限於樣品的分子量大小，且針對澱粉樣蛋白質纖維這種不結晶且不溶於水的樣品，或者是磷脂環境下的膜蛋白（近天然環境中下的結構）以及其他生物大分子複合物，則優勢明顯，成為結構解析生物大分子結構的有力工具。

NMR技術解析的7K3G蛋白模型。圖源: PDB

NMR不僅可以解析出原子解析度水平的結構，同時還可以提供動力學以及分子間相互作用等重要信息。不過，該技術需要藉助於2H，13C和15N同位素標記的樣品，成本較高；同時，核磁數據的解析、譜圖信號的歸屬也是一項複雜的工作，尤其是分子量大的生物大分子，核磁譜圖複雜，也為後續的結構解析工作帶來了挑戰。

冷凍電鏡技術

1968年科學家首次運用電子顯微鏡三維重建技術，重建了T4噬菌體（屬於大腸桿菌T系噬菌體，為烈性噬菌體）尾部的三維結構。1974年低溫電子顯微鏡技術得以提出並發展。經過30多年的發展，Cryo-EM已成為研究生物大分子結構的有力工具。

大腸桿菌的顯微照片。圖源: 維基百科

近年來，Cryo-EM技術取得了革命性的進展，特別是在單一粒子分析方面。自2013年以來，隨著電子探測器和圖像處理的巨大進步，Cryo-EM單粒子分析進展非常迅速，Cryo-EM的解析度現在可與單晶 X 射線衍射相媲美。

目前，Cryo-EM正在成為解析生物大分子高解析度結構的有力工具。該技術的優點主要體現在可以通過快速冷凍處理技術，保持樣品的原生狀態，不需要蛋白質結晶，僅用毫克級樣品（約0.1毫克），即可獲得高解析度的結構。此外該技術對樣品純度的要求並不苛刻，對於某些難以通過表達純化獲得較高純度的膜蛋白來說，非常友好。

圖源: 阿里雲

目前Cryo-EM對生物大分子的結構測定，能夠比較容易地獲得大型複合物（300 kDa以上的蛋白質）在原子解析度水平的結構。然而，針對200 kDa以下的蛋白質，因為其顆粒在冷凍樣品中襯度不足，會導致很難獲取其高解析度的結構信息。

上文簡述的三種方法，各有所長。其實，沒有任何一種技術是萬能的，我們在做科研的過程中必須要有全局意識，並在每一階段及時權衡利弊。將傳統技術與新技術進行優勢互補，有機結合，不斷以協作共贏的態度去尋求突破。