【單細胞文獻解讀】靶向治療誘導肺癌進化

導語

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肺癌是全球範圍內發生率和死亡率最高的惡性腫瘤，而遠端轉移是肺癌致死率的主要原因。靶向治療雖然可以延緩部分患者的生命，但肺癌的異質性仍會導致腫瘤細胞適應新環境，出現耐藥。只有了解治療前後腫瘤和微環境的進化過程以及異質性，才能更好指導靶向用藥，改善治療療效。

單細胞技術是當今科學研究的'super star'，它可以提供更豐富、更精確的內容。而目前關於單細胞的研究大多數還停留在繪製腫瘤單細胞圖譜上，而在臨床中應用中的研究較少。今天小編和大家分享一篇  單細胞應用於臨床的研究  ，於2020年8月發表在Cell (IF:38.637)上，探索靶向治療前後肺癌的進化。

入組：30例肺癌患者，共49個組織樣本，並進一步將樣本分為如下三類：

• TN--未接受靶向治療的樣本

• RD--對靶向治療後有響應的樣本

• PD--經靶向治療後獲得性耐藥的樣本

49個晚期NSCLC樣本（3個癌旁、45個非腺癌、1個肺鱗癌），共獲得23,261個細胞，聚類成三類細胞：免疫細胞、基質細胞（包括成纖維細胞、內皮細胞、黑素細胞）以及上皮細胞。

利用單細胞轉錄組數據推測拷貝數變異，進而區分癌和非癌細胞  

癌症通常會伴隨著大規模的染色體水平變異，作者基於單細胞RNA表達數據來推測拷貝數 變異(CNV)，並進一步區分出癌細胞和非癌細胞，發現：

• 癌細胞中，有大片段染色體內的基因同時高表達或低表達，而成纖維細胞與內皮細胞則沒有。

• 癌細胞比非癌細胞整體表達水平更高。

• 通過無監督的聚類分析，發現來源於正常組織中的細胞(紫色)與癌細胞聚成不同的類。

• 大多數的癌細胞簇都是來自特定的患者，而患者之間share的癌細胞較少，反映了個體之間腫瘤分子的異質性。

利用單細胞轉錄組，在癌細胞中識別突變。

基於單細胞轉錄組數據，識別到了一些臨床上常見的driver基因突變，同時，在一些樣本中還鑑定出了新的突變。

• RD比TN呈現更高的肺泡signature(圖A)。

• 通過RT-PCR的正交驗證，發現肺泡的標誌性基因NKX2-1在RD中表達高於Control組和獲得性耐藥的細胞，說明在RD組中肺泡信號被激活（圖B）。

• 通過免疫組化驗證肺泡的另一個標誌性基因AQP4，在RD樣本的質膜誘導了AQP4蛋白表達（圖C），而在TN和PD組AQP4則沒有表達。

• 利用外部TCGALUAD RNASeq數據，發現這些肺泡生物標記物的高表達可以改善患者的總體生存（圖D）。
  

• 在早期使用TKI藥物、同時抑制WNT/β-catenin信號通路，可以減少細胞的融合度，提高藥物的響應程度（圖G-J）。

• 比較RD組和PD組的癌細胞轉錄組，發現了PD組過表達的基因參與了侵襲、細胞間通訊、分化以及免疫調節等功能。

• 在PD組中，發現纖溶酶原激活途徑中的幾個基因(ANXA2, PLAT, PLAUR, PLAU)以及纖溶酶原抑制劑SERPINE1(PAI1)同時高表達(圖N,圖O)。

• 利用TCGA的LUAD RNASeq數據分析，發現纖溶酶原激活Signature高表達組中，患者的總生存OS更差(圖P)。

• 利用TCGA的LUAD RNASeq數據分析，發現纖溶酶原抑制劑SERPINE1高表達的組中，患者的總生存OS更差(圖Q)。

• PD組中呈現更高的間隙蛋白Signature(圖R)。

• 利用TCGA的LUAD RNAseq數據分析，發現間隙蛋白GJB2/3/5的高表達表現出較差的預後(圖S)。

對來自同一患者的TN,RD, PD樣本進行分析，來探索靶向治療期間腫瘤微環境的演變， 發現：

• 在PD中高表達了很多鱗狀細胞分化相關的基因(KRT16, KRT14, KRT6A, KRT5, CLCA2, PKP1, ANXA8, DSG3)，說明在PD階段表現出部分鱗癌的特徵，該患者的腫瘤活檢中也顯示由前期的純腺癌在後期轉變為鱗狀細胞癌。

• 對所有的免疫細胞(n =13,431)進行聚類和注釋分析，共獲得9個免疫細胞亞型(圖A-B)。

• 比較TN-TD-PD三組之間各個免疫細胞的變化，發現在所有治療節點，T細胞和巨噬細胞都是細胞數目最多的亞群 (圖C)。

• RD期間浸潤了較多的T淋巴細胞，以及較少的巨噬細胞 (圖C)。

• 對TCGA的LUAD RNAseq數據進行去卷積來預測免疫細胞浸潤情況，發現巨噬細胞浸潤較高的分組中患者的總生存OS更差。

巨噬細胞(n= 1,379)進一步聚類，細分成5個亞群，並進行marker基因的注釋(圖A-B)。

• MF0：在 靶向治療之前--TN 富集，且表達了與免疫抑制表型相關的基因(C1QC，GPNMB，APOE，TREM2，FOLR2)。

• MF1：在 靶向治療響應期--RD 富集，表達了一些髓系來源的抑制細胞marker (FCN1，VCAN，S100A8，S100A9) 以及炎症的消退、傷口癒合和抑制IL-1b的基因 (THBS1 and PTX3)。

• MF2：在 疾病進展期--PD 富集，表達了一些促炎因子(CXCL9，CXCL10，CXCL11)，同時也在PD期特異性表達了IDO1。

• MF3：在靶向治療響應期 (RD) 富集，表達了與組織損傷的促炎反應相關基因(CLEC2D，IL7R，OGT)，以及促進炎症信號傳導的基因(FYN，DUSP4，FOXO1)。

• MF4：在靶向治療的三個時間節點上無明顯規律，該cluster表達了增殖的髓系細胞基因(TOP2A, MKI67)。

T/NK細胞(n = 2,226)進一步聚類，細分成5個亞群並，進行marker基因的注釋(圖C-D)。

• 在RD腫瘤中，T細胞總體比例較高(圖4C)，且沒有單個T細胞亞簇在RD中富集。

• TC0：在 靶向治療之前--TN 富集，表達了與naïve-like CD8+表型相關的基因(CCR7, IL7R, SELL)。

• TC1：在 疾病進展期--PD 富集，表達了一些功能失調或耗竭型的marker (PDCD1, CTLA4)。

• TC2：在 疾病進展期--PD 富集，表達了Treg相關的基因 (FOXP3, IL2RA)。

• TC3：在每個治療節點都存在，在疾病進展期—PD輕微富集，同時表達了毒性基因(CD8, GZYMA) 以及PDL1/CTLA4， 可能代表了一個殺傷功能失活之前的T細胞亞群。

• TC4：在 靶向治療之前--TN 富集，表達了NK細胞或NKT細胞的marker基因(KIR2DL3, FCGR3A)以及T細胞的marker基因(CD3, CD8)。

小結：

這是一篇典型的單細胞 應用於臨床場景的研究。在課題設計上，將焦點放在：在 靶向治療前(TN)，靶向治療後有效果(RD)、靶向治療後進展(PD)三個階段的樣本中，進一步比較三者之間 上皮細胞、免疫細胞的特徵，繪製靶向治療前後TN->RD->PD的細胞進化譜和腫瘤微環境，探索耐藥原因，進一步指導患者的治療。

MaynardA, McCoach CE, Rotow JK, et al. Therapy-Induced Evolution of Human Lung CancerRevealed by Single-Cell RNA Sequencing [published online ahead of print, 2020Aug 7]. Cell. 2020;S0092-8674(20)30882-5. doi:10.1016/j.cell.2020.07.017