臨床多重耐藥菌基因組編輯研究取得進展

2020-12-08 中國科學院

　　直接在臨床分離的多重耐藥菌中進行功能基因組學研究是解析耐藥機制以及開發抗耐藥策略最直接有效的方法。然而，由於缺乏能在臨床耐藥菌中直接進行高效基因編輯的工具，目前耐藥機制仍主要是採用組學分析加在模式菌中的異源驗證進行研究。這種脫離了臨床耐藥菌本身遺傳背景的研究策略，往往忽略了遺傳背景本身對耐藥因子的影響以及不同耐藥因子之間的相互關係，很多時候無法對臨床抗耐藥研發提供真正有效的依據。開發一種能與臨床菌複雜各異的基因型兼容、並且簡便高效的基因組編輯方法將有助於打破這一研究壁壘。

　　中國科學院微生物研究所向華團隊長期從事微生物CRISPR-Cas系統分子機制的研究，在致力於開發基因編輯新元件新機制的同時，近年來積極倡導利用原核微生物自身的CRISPR-Cas系統發展重要原核微生物基因組編輯技術，推動對微生物世界生命機制更加深入系統的理解和開發應用。11月5日，向華團隊和香港大學閆愛新團隊聯合在Cell Reports上發表了題為Native CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing Enables Dissecting and Sensitizing Clinical Multidrug-Resistant P. aeruginosa 的文章。作者以多重耐藥研究中最重要的標準參照病原菌銅綠假單胞菌作為研究對象，報導了在臨床多重耐藥銅綠假單胞菌中開發基於內源性I-F型CRISPR的、高效簡便的基因編輯系統，並在該系統的輔助下，實現了在臨床多重耐藥菌株自身遺傳背景下耐藥機制的原位解析和抗耐藥化合物的篩選。

　　銅綠假單胞菌是當前亟需關注的七種病原細菌「ESKAPE」（腸球菌屬，金黃色葡萄球菌，克雷伯菌，鮑曼不動桿菌，銅綠假單胞菌和腸桿菌屬）之一。由於該病原菌極易產生多重耐藥性，現有的抗生素療法不僅不能有效地根治其感染，阻止耐藥性的傳播，還會破壞宿主的益生菌群，對人體健康產生極大的副作用。早先，閆愛新團隊對2015-2016年香港瑪麗醫院各種感染性疾病包括傷口、尿道、耳部、膿液、引流液及血液感染的患者中分離的銅綠假單胞菌進行了耐藥檢測並報導了一株有潛在流行性特徵的多重耐藥菌PA154197。然而，研究人員嘗試了傳統的雙交換同源重組策略和基於外源Cas9的雙載體編輯系統均未能實現對該菌株基因組的編輯，這嚴重阻礙了對其耐藥性機制的深入解析。全基因組測序結果顯示PA154197含有1個完整的內源性I-F型CRISPR-Cas系統。他們通過與向華團隊合作，基於該系統共同開發出了一套具有抗性基因和報告基因雙篩選標記的單質粒基因編輯系統。該系統包含一個由強啟動子（Ptat）驅動的mini-CRISPR元件（用於表達crRNA）和luminescence報告基因（luxCDABE）（用於輔助陽性克隆篩選），並同時含有同源重組的donor片段和用於克隆篩選的卡那黴素抗性基因。通過電轉法將該質粒轉入PA154197後，研究人員通過對具有明顯螢光信號的轉化子進行進一步PCR及測序驗證，能夠快速（一周以內）獲得陽性克隆，並同時實現了對其基因組高效、多樣化的精準編輯（包括基因敲除、DNA插入和定點突變等）。值得一提的是，基於螢光信號的陽性克隆初篩策略巧妙地規避了耐藥菌在抗生素篩選下假陽性率高的難題，大大降低了克隆篩選的工作量。進一步的研究表明這一系統也適用於其它含有I-F型CRISPR的環境和臨床銅綠假單胞菌株，如分離自北太平洋的Ocean-100和另一株臨床菌株PA150567。基於這套高效的基因編輯系統和前期的基因組與轉錄組分析，研究人員構建了一系列突變菌株並揭示了PA154197中三個關鍵的耐藥突變（mexR:T226G; mexT:8bp 缺失；gyrA:T248C）以及它們之間顯著的協同關係。隨後利用這一系列突變菌株對多種抗菌化合物進行了耐藥性檢測，研究人員發現該耐藥菌對陽離子擬肽類小分子（Small Cationic Peptidomimetics）與多種抗生素表現出顯著的負相關的伴隨性敏感現象（Collateral Sensitivity），並且該伴隨性敏感現象主要依賴於其中的一個耐藥突變（mexT）。最後研究人員證明了陽離子擬態類小分子通過作用於耐藥菌的外膜從而能夠顯著提高該耐藥菌對抗生素的敏感性，以及陽離子擬態類小分子與抗生素的聯用能夠有效地抑制耐藥菌的生長並對耐藥菌有特異高效的殺滅效果。

　　該研究首次利用內源性I-F型CRISPR系統實現了對多重耐藥菌的基因編輯，由於I-F型CRISPR系統普遍存在於多重耐藥的銅綠假單胞菌中（70%），這將為臨床耐藥菌的研究提供高效、簡便的基因編輯方法和一種原位耐藥性解析的新策略。此外，該研究對臨床多重耐藥菌的耐藥機理進行了解析並發現了該菌對陽離子擬態類小分子的伴隨性敏感現象。這一新發現將為解決臨床抗耐藥應用提供新的思路和手段。

　　香港大學博士徐澤凌和中科院微生物所副研究員李明為該文章共同第一作者，閆愛新和向華為共同通訊作者。相關工作得到國家自然科學基金和香港大學等相關基金的支持。

　　論文連結

　　圖：臨床多重耐藥銅綠假單胞菌基因組編輯、耐藥機制解析及防治策略（摘自Cell Rep, 2019: doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.006）

相關焦點

  • 微生物所在病原菌耐藥基因組學研究中取得系列進展
    中國科學院微生物研究所在2014年初揭牌成立了「病原微生物耐藥和耐藥基因組學北京市重點實驗室」，專門從事耐藥微生物的基因組學、耐藥機制及傳播機制的研究。繼2013年8月和2014年初重點實驗室朱寶利研究組在Nature Communications，Scientific Reports 和Gut Microbes上發表了人體腸道細菌耐藥基因與動物抗生素使用之間的相關性及耐藥基因隨個體年齡變化的規律的研究工作後，近來在臨床病原菌的耐藥基因組學研究中又取得了系列新進展。
  • 抗生素耐藥科普——多重耐藥菌
    除了染色質攜帶的基因變異，有些變異存在於細菌的一種叫質粒的結構上，由於質粒可以在不同細菌之間自由橫向穿梭，容易把耐藥基因直接傳給附近的其他細菌，導致另一形式的耐藥基因的擴散。當一種細菌對多種原本對它有效的抗菌藥物發展出耐藥，我們可稱之為多藥耐藥或多重耐藥(multidurg-resistance，MDR)。
  • 多重耐藥菌治療的挑戰,XDR革蘭氏陰性菌聯合藥敏引熱議
    近年來，隨著抗生素的廣泛使用，多重耐藥菌逐漸成為醫院感染的重要病原菌。CRE、CRKP、XDRAB、XDRPA等多重耐藥菌已成為院內感染最為關切的重要病原體，由其導致的感染,臨床治療非常困難，死亡率高。
  • mBio:首次揭示質粒編碼的可介導替加環素耐藥的新型多重耐藥外排泵
    醫學中文網訊：近期，mBio在線發表了關於肺炎克雷伯菌質粒上發現的一種新型可介導替加環素等藥物耐藥的多重耐藥外排泵基因簇（tmexCD1-toprJ1）的研究論文，該研究系統性地闡述了tmexCD1-toprJ1耐藥基因簇的功能、起源以及流行情況。
  • 「多重耐藥菌」抬高治療費10倍
    多重耐藥菌檢出率達40%4月7日，記者從全國超級細菌定點監測醫院—中國醫科大學附屬盛京醫院了解到，經過半年多的監測，目前瀋陽尚未檢測出致命「超級細菌」NDM-1的蹤影。不過，瀋陽幾家大型三級醫院每季度都會對耐藥菌種類進行統計並反映給臨床醫生，結果顯示，耐藥菌種類不斷增加，耐藥程度逐年增強。
  • 多重耐藥菌防控的「術、法、道」
    ——山東省第三屆多重耐藥菌感控「天御千菌」論壇報導2017 年 4 月 22 日，由青島市醫學會主辦，青島大學附屬醫院承辦的「山東省第三屆多重耐藥菌感控「天御千菌」論壇在青島市召開。
  • 盤點:對抗多重耐藥的10款新型抗生素
    鑑於強勁的療效、靈活的給藥劑量、以及針對最常見的CABP病原體——包括多重耐藥菌株表現出的目標譜活性，Nabriva公司已將lefamulin的臨床開發定位為當前臨床金標準的替代選擇。此外，lefamulin針對一些最常見的性傳播感染也表現出顯著療效。
  • 癲癇的基因檢測和蛋白質組學研究
    就科研方面而言，研究已識別出的基因突變對於神經生理及神經發育的影響有助於闡明發作易感性的機制。就臨床方面而言，識別基因突變有助於對疑似病例進行明確診斷，並對開發新的治療手段提供有價值的信息。因此，基因檢測的重要性受到研究人員及臨床醫師的普遍關注。
  • 深圳首例應用噬菌體治療臨床試驗取得進展
    「深圳首例應用噬菌體治療耐藥菌感染在深圳市人民醫院臨床試驗獲得重要進展，該臨床研究表明應用噬菌體治療臨床超級耐藥菌的感染具有極大的應用價值。」治療團隊經過前期的肺部痰液培養物檢測發現了兩種常見病原菌銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌，對這兩種菌進行的藥敏測試顯示，其中鮑曼不動桿菌對多種抗生素耐藥。治療團隊經過評估制定了詳細的治療方案，並採取抗生素和針對耐藥鮑曼不動桿菌的專一性噬菌體聯合霧化給藥的方式，經過連續兩個星期的治療，成功清除了患者肺部感染的耐藥鮑曼不動桿菌，患者病情穩定。
  • 水環境耐藥基因研究獲進展
    細菌的耐藥基因是自然環境中新出現的一種潛在威脅。細菌獲得耐藥基因，將損壞抗生素治療的效果。同時，耐藥基因可通過水平基因轉移（HGT）從一種細菌轉移到另一種細菌。但是，目前水環境中耐藥基因與細菌之間的相關關係尚不清楚。
  • 我國科學家取得乳腺癌研究新進展
    新華社北京4月29日電（記者田曉航）由中國人民解放軍總醫院第五醫學中心江澤飛教授領銜的「西達本胺聯合依西美坦治療激素受體（HR）陽性絕經後晚期乳腺癌的Ⅲ期臨床研究（ACE研究）」，日前在國際權威腫瘤學雜誌《柳葉刀·腫瘤學》在線發表。這項研究成果為部分乳腺癌患者提供了新的治療選擇。
  • 小腸結腸炎耶爾森氏菌，耐藥小刺頭啟發抗菌新思路
    不過，小腸結腸炎耶爾森氏菌在臨床上的抗生素耐藥情況非常嚴重，而抗生素在養殖業的長期使用，更加劇了致病菌抗生素耐藥性的問題。，針對我國4省份的禽肉中分離出的25株小腸結腸炎耶爾森氏菌進行分析，發現全部耐3類及以上抗生素（多重耐藥株），耐4類及以上抗生素的比例為
  • Cancer Cell|腫瘤耐藥研究又有新進展!「基因突變」或許不是必要條件
    臨床上，通過化療的癌症患者，通常都會有一段時間的緩解期，遺憾的是，在緩解期後，病情往往會出現進展，並且復發的腫瘤細胞還將出現對原有化療藥物的耐藥現象。解釋耐藥現象出現的原因，一直是科學家不斷探索的領域。
  • 革蘭陰性桿菌耐藥機制及治療對策
    革蘭陰性桿菌在臨床上分離率較高，分為5 類：腸桿菌科需氧或兼性厭氧菌（志賀菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬），弧菌科細菌（弧菌屬、氣單胞菌屬），絕對需氧菌（葡萄糖非發酵菌如銅綠假單胞菌、不動桿菌），絕對厭氧菌（擬桿菌、梭桿菌）以及其他（布魯菌、軍團菌、螺桿菌）等。
  • 多重耐藥菌(MDRO)(第三期)|有這樣一種菌,它叫Acinetobacter baumannii(Ab)
    全國細菌耐藥監測網（CARSS）相關監測數據3. CHINET中國細菌耐藥監測結果(2017年)4.本系列既往期連結：開篇：我國多重耐藥菌防控宏觀概述多重耐藥菌（MDRO）（第二期）丨What? 頂級醫院發生MDRO院感暴發，居然還發表在新英格蘭（NEJM）
  • 我國科學家基因編輯成體造血幹細胞移植研究取得重要進展
    陳愛平 攝新華社北京9月17日電（戴欣）我國科學家在愛滋病合併白血病患者的基因編輯成體造血幹細胞移植研究上取得重要進展：建立了基於CRISPR在人成體造血幹細胞上進行CCR5基因編輯的技術體系，實現了經基因編輯後的成體造血幹細胞在人體內長期穩定的造血系統重建，為後續基因編輯治療的安全性和有效性研究奠定了基礎。近日，相關研究成果在國際頂級醫學期刊《新英格蘭醫學雜誌》發表。
  • 「綜述」腸道微生態和腸菌移植與呼吸系統疾病的研究進展
    腸菌移植（intestinal microbiota transplantation）是一種通過移植健康供體腸道菌群至患者胃腸道內，重建腸道菌群的一種新興治療方法，其對於機體腸道菌群正常結構的恢復、調節內環境穩態、治療多種疾病的療效已得到多項研究結果證實［5, 6, 7］。本文總結了腸道微生態、腸菌移植與呼吸系統疾病關係的研究進展，為未來的治療提供新思路。
  • 邀請函 | 基因科學 引領未來,2020年賽默飛基因科學與臨床測序業務...
    基因科學，引領未來圍繞「基因科學，引領未來」主題，賽默飛將在北京，上海，廣州和武漢四地舉辦基因科學與臨床測序業務高端用戶會，召集行業專家分享一線經驗，為基因分析領域人士搭建交流平臺，助力基因測序研究與應用發展。
  • 研究發現抗多藥耐藥革蘭氏陰性菌候選藥物
    細菌耐藥性特別是革蘭氏陰性菌的耐藥性已成為危害人類健康的重大威脅，目前臨床上極度缺乏安全有效的治療多藥耐藥革蘭氏陰性菌感染的藥物，全球範圍內處於臨床研究的候選藥物更是寥寥無幾。列為極為重要的包括耐碳青黴烯類藥物的鮑曼不動桿菌（CRA）、綠膿桿菌和產超廣譜β-內醯胺酶（ESBLS）腸桿菌科（CRE）三種細菌，均為多藥耐藥性革蘭氏陰性菌。因此研發廣譜、強效抗多藥耐藥革蘭氏陰性菌藥物是臨床上十分迫切的巨大需求。研發高效抗多藥耐藥性革蘭氏陰性菌藥物是世界難題，因為陰性菌耐藥機制遠比陽性菌複雜多變。
  • CRISPR/Cas基因編輯技術最新研究進展
    CRISPR/Cas系統是目前發現存在於大多數細菌與所有的古菌中的一種後天免疫系統，其以消滅外來的質體或者噬菌體並在自身基因組中留下外來基因片段作為CRISPR-Cas技術是繼鋅指核酸酶（ZFN）、ES 細胞打靶和 TALEN 等技術後可用於定點構建基因敲除大、小鼠動物的第四種方法，且有效率高、速度快、生殖系轉移能力強及簡單經濟的特點，在動物模型構建的應用前景將非常廣闊。因此本文中小編對CRISPR/Cas的最新研究進展進行了匯總盤點。